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                        科學研究

                        王頗課題組科研進展(二)

                        發布者:邢蓓蓓發布時間:2020-05-22瀏覽次數:10

                        王頗老師課題組主要開展功能化納米傳感體系的構建及其在生化分析中的應用研究,在電化學界面構建、信號放大技術的發展、核酸與細胞分析AG真人第一品牌游戏、疾病診斷、表觀遺傳學的研究等方面取得了階段性進展AG真人第一品牌游戏,已主持2項國家自然科學基金和1項江蘇省重點研發計劃項目。近三年,以通訊或第一作者在Analytical Chemistry2篇)AG真人第一品牌游戏,ACS Sensors,LangmuirAG真人第一品牌游戏,Biosensors and Bioelectronics,Electrochemistry Communications,ACS Applied Bio Materials等國際權威期刊發表論文18篇AG真人第一品牌游戏。其中一區論文12篇AG真人第一品牌游戏,含ESI高被引論文1篇(Analytical Chemistry, 2018, 90, 1098?1103)AG真人第一品牌游戏AG真人第一品牌游戏,其學科領域百分位位居前千分之一(基準閾值為0.09%,2020520日數據),研究簡介見“王頗課題組科研進展(一):http://chem.jsnu.edu.cn/aa/e5/c5482a240357/page.htm”AG真人第一品牌游戏。發表的論文先后被Nature Reviews ChemistryAG真人第一品牌游戏,Chemical Reviews,Chemical Society Reviews等國際著名綜述正面評價和引用,引起了同行的廣泛關注。王頗老師先后入選江蘇省“六大人才高峰”高層次人才、江蘇省“青藍工程”優秀青年骨干教師;并獲得徐州市“十大青年科技獎”AG真人第一品牌游戏、“淮??茖W技術一等獎”、“江蘇省分析測試科學技術二等獎”、“江蘇省高校自然科學三等獎”AG真人第一品牌游戏、徐州市發明協會科學技術“突出貢獻獎”等獎項。

                        1. 基于CRISPR/Cas13a信號放大的飛摩爾蛋白免疫檢測

                        本工作利用CRISPR/Cas13a代替傳統酶聯免疫分析(ELISA)中酶催化底物顯色作為信號輸出機制,利用T7 RNA聚合酶的轉錄和Cas13a的反式切割活性兩步放大輸出信號,實現了飛摩爾水平的蛋白檢測。將生物素標記的一端含有T7啟動子序列的雙鏈DNA連接到“捕獲抗體-抗原-鏈霉親和素標記的檢測抗體”復合物上,加入T7 RNA聚合酶后,T7 RNA聚合酶能夠識別T7啟動子并開始轉錄出多個觸發RNA,實現信號的第一步放大AG真人第一品牌游戏。Cas13acrRNA引導識別并切割觸發RNA,觸發RNA被切割后,可激活Cas13a的反式切割活性剪切體系中的RNA熒光探針(一端標記熒光團AG真人第一品牌游戏,另一端標記淬滅團,此時熒光被淬滅)。熒光探針被剪切AG真人第一品牌游戏,使得淬滅團遠離熒光團,熒光得以恢復。一個觸發RNA可觸發約10000個熒光探針的剪切,實現了信號的第二次放大。本工作成功檢測到飛摩爾水平的人白細胞介素6Human IL-6)和人血管內皮生長因子(Human VEGF),檢出限分別為2.29 fM0.81 fMAG真人第一品牌游戏。該體系的整個反應過程在37 °C下進行,與用于洗板和試劑分散的高通量液體處理機器人兼容,可以同時檢測多種蛋白AG真人第一品牌游戏,實現高通量篩選和定量的目的,其靈敏度超過商業化試劑盒的100倍AG真人第一品牌游戏,可檢測常規ELISA無法檢測到的低豐度蛋白。該方法是首次基于CRISPR/Cas13a系統構建的低豐度蛋白免疫分析法,相關原理如圖1所示AG真人第一品牌游戏,研究成果以2017級碩士研究生陳倩同學為第一作者發表于Analytical Chemistry, 2020, 92, 573?577。

                        1. 基于CRISPR/Cas13a信號放大的免疫檢測原理示意圖

                        2. 基于超級三明治串聯體信號放大的DNA甲基化雙信號識別體系

                        本工作以二茂鐵(Fc)和亞甲基藍(MB)為信號標記,基于DNA串聯體的信號放大策略,構建了一種靈敏而又準確的電化學生物傳感器,實現了DNA甲基化的雙信號識別AG真人第一品牌游戏。利用亞硫酸鹽轉化技術,非甲基化DNA分子結構中的胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U),而甲基化DNA分子中的5-甲基胞嘧啶(5-mC)保持不變AG真人第一品牌游戏。以金納米粒子功能化的二硫化鉬修飾玻碳電極(AuNPs@MoS2/GCE)為傳感界面AG真人第一品牌游戏,根據DNA序列信息的不同,可檢測DNA的甲基化狀態?;诓东@DNA和信號DNA的巧妙設計,一分子的目標DNA可連接多個DNA信號探針AG真人第一品牌游戏,形成超級三明治串聯體結構AG真人第一品牌游戏,顯著放大了檢測信號AG真人第一品牌游戏,提高了分析方法的靈敏度。將電活性的FcMB同時標記到信號DNA分子中,達到了雙重信號識別的目的,增加了檢測結果的準確度。AuNPs@MoS2/GCE呈現出良好的界面電化學性質,為信號導出奠定了基礎。在優化的實驗條件下,該方法可有效識別DNA的甲基化位點,并獲得了滿意的分析參數,線性范圍和檢出限分別是10 fM?1 nM450 aM。相關原理如圖2所示,研究成果發表于ACS Sensors, 2019, 4, 2615?2622。


                        2. 基于超級三明治串聯體信號放大的DNA甲基化雙信號識別原理示意圖

                        3. 胞嘧啶調控的電致化學發光共振能量轉移體系的構建及應用

                        在電致化學發光(ECL)體系中,能量供體的ECL光譜與受體吸收光譜的重疊是有效實現ECL共振能量轉移(RET)的基本要求。作為一種常見的ECL發光試劑,CdS量子點(QDs)在520 nm處有較寬的ECL發射峰AG真人第一品牌游戏,因此,尋找具有520 nm吸收光譜的納米材料是構建ECL-RET傳感器的關鍵AG真人第一品牌游戏。本工作利用核酸包裹的Ag納米簇的導電性、催化性能以及Ag納米簇的吸收光譜與CdS QDs的發射光譜之間的重疊AG真人第一品牌游戏,構建了一種新型的ECL-RET傳感體系AG真人第一品牌游戏AG真人第一品牌游戏,并將其應用于miRNA-21的檢測。簇核酸序列中胞嘧啶的分子個數影響著Ag納米簇的形成。通過調節胞嘧啶的分子個數,得到紫外吸收峰位于520 nmAg納米簇,與CdS QDsECL發射光譜重疊,產生有效的ECL-RETAG真人第一品牌游戏。此外,基于雙鏈特異性核酸酶和催化發卡組裝引起的目標循環信號放大,該體系的靈敏度得到了有效的提高。據此建立了一種miRNA-21檢測的新方法,其線性范圍是1 fM?100 pM,該方法已成功應用于HeLa細胞提取物中miRNA-21的檢測AG真人第一品牌游戏。相關原理如圖3所示,研究成果發表于Langmuir, 2018, 34, 10153?10162。

                        3. 胞嘧啶調控的電致化學發光共振能量轉移體系的構建原理示意圖

                        4. 基于DNA步行器的信號放大策略及其傳感應用

                        本工作基于目標驅動的DNA步行器體系,構建了一種高靈敏的電化學傳感器,并將其應用于目標DNA的電化學檢測AG真人第一品牌游戏。金納米籠具有中空、多孔的籠狀結構,可有效提高納米材料的電活性面積,增加探針DNA的負載密度AG真人第一品牌游戏。以石墨烯功能化的金納米籠為傳感界面,結合DNA 步行器和Exo III信號放大策略,可顯著提高分析方法的靈敏度。本工作通過對發夾式DNA探針的巧妙設計,實現了目標DNA的序列識別和定量檢測。與傳統的方法相比,該方法顯示出良好的選擇性和較低的檢出限,可應用于復雜樣品中低豐度DNA含量的檢測,揭示了該方法的實用價值。相關原理如圖4所示,研究成果發表于Biosensors and Bioelectronics, 2018, 108, 97?102。


                        4. 基于DNA步行器信號放大策略的生物傳感原理示意圖

                        5. 紙芯片傳感界面的電化學構建及其在亞硝酸鹽檢測中的應用研究

                        直接氧化法是檢測電活性物質的一種重要方法,然而,在傳統的工作電極上,氧化產物容易堆積在電極表面,產生污染效應AG真人第一品牌游戏,影響了檢測結果的準確度和重現性AG真人第一品牌游戏。本工作以真空抽濾技術為基礎,基于電化學方法,構建了一種簡單、便宜、易制備的紙芯片傳感界面,并將其應用于亞硝酸鹽的電化學檢測AG真人第一品牌游戏,結果令人滿意。石墨烯是一種性質良好的電極材料AG真人第一品牌游戏,采用真空抽濾技術將其組裝到濾紙表面,從而得到了一種導電性薄膜。然后AG真人第一品牌游戏,將此薄膜剪切成芯片AG真人第一品牌游戏,制備工作電極,并在此工作電極上電沉積金納米粒子,即可得到功能化的紙芯片電極AG真人第一品牌游戏。紙芯片電極的價格便宜AG真人第一品牌游戏,可作為一次性的傳感器件AG真人第一品牌游戏,有效解決電極的污染問題。研究結果表明AG真人第一品牌游戏,紙芯片電極對亞硝酸鈉具有良好的催化活性,可放大亞硝酸鈉的電流信號AG真人第一品牌游戏,從而提高分析方法的靈敏度。此檢測技術可應用于牛奶、湖水AG真人第一品牌游戏、河水和工業廢水中亞硝酸鹽的定量檢測,分析結果與標準方法相符合。因此,本工作的開展在食品安全和環境監控等領域具有一定的理論意義和實用價值。相關表征數據和測試性能如圖5所示AG真人第一品牌游戏,研究成果發表于Electrochemistry Communications, 2017, 81, 74?78AG真人第一品牌游戏。

                        5. 紙芯片傳感界面的形貌表征及其對亞硝酸鹽的電化學檢測

                        感謝國家自然科學基金面上項目(21675067)、青年項目(21205052)AG真人第一品牌游戏、江蘇省“六大人才高峰”高層次人才培養計劃(SWYY-084)、江蘇省“青藍工程”培養計劃、江蘇省重點研發計劃(BE2019645)的資助AG真人第一品牌游戏;感謝學院提供的資源條件;感謝課題組馮秋梅老師,陳倩、王夢影、嚴己、秦莉AG真人第一品牌游戏、趙曉蕾AG真人第一品牌游戏、周慧等同學的辛勤工作AG真人第一品牌游戏。


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